Patoloji nedir ve doku takibi aşamaları

 Patoloji nedir?

Patoloji, hastalık bilimidir. Hastalıkların nedenlerini, gelişimini, belirtilerini ve etkilerini inceleyen bir bilim dalıdır. Patoloji, tıp alanında önemli bir yere sahiptir. Hastalıkların tanısı, tedavisi ve önlenmesi için gerekli olan bilgilere patolojiden elde edilir.

Patoloji, iki ana daldan oluşur:

• Klinik patoloji: Hastalıkların tanısı ve tedavisi için gerekli olan bilgilere odaklanır. Klinik patologlar, hastalardan alınan doku ve sıvı örneklerini inceleyerek hastalıkların tanısını koyar. Ayrıca, tedavinin etkinliğini izlemek ve yeni tedavi yöntemleri geliştirmek için çalışırlar.
• Araştırma patolojisi: Hastalıkların nedenlerini, gelişimini ve tedavisini anlamak için yapılan araştırmalara odaklanır. Araştırma patologları, laboratuvar ortamında çeşitli araştırmalar yaparak yeni bilgilere ulaşmayı amaçlar.

Patolojinin başlıca çalışma alanları şunlardır:

• Hastalık tanısı: Patoloji, hastalıkların tanısında önemli bir rol oynar. Patologlar, hastalardan alınan doku ve sıvı örneklerini inceleyerek hastalıkların tanısını koyar. Örneğin, kanser tanısı için genellikle biyopsi yapılır ve biyopsi örneği patolog tarafından incelenir.
• Tedavi seçimi: Patoloji, tedavi seçimi için de önemli bir rol oynar. Patologlar, hastalıkların nedenlerini ve gelişimini anlayarak tedavi seçeneklerini belirlemeye yardımcı olur. Örneğin, kanser tedavisinde, kanserin türüne ve evresine göre farklı tedavi yöntemleri uygulanır. Patologlar, kanserin türünü ve evresini belirlemek için biyopsi örneklerini inceler.
• Hastalık önlenmesi: Patoloji, hastalık önleme için de önemli bir rol oynar. Patologlar, hastalıkların nedenlerini ve gelişimini anlayarak hastalık riskini azaltmaya yönelik çalışmalar yapar. Örneğin, kanser riskini azaltmak için sigara içmemek, sağlıklı beslenmek ve düzenli egzersiz yapmak gibi önlemler alınabilir. Patologlar, bu önlemlerin etkinliğini değerlendirmek için araştırmalar yapar.

doku takibi yapılmadan önce makroskobik inceleme yapılır. 

Doku takibi aşamaları 

1.  fiksasyon (tespit)
2. dehidrasyon (suyu alma ve sertleştirme)
3. saydamlaştırma
4. parafinizasyon - parafine gömme
5. blok hazırlama
6. kesit alma
7. boyama
8. kapama

fiksasyon - tespit

Bu aşamanın amacı dokuların çürümesini önlemek ve canlı hallerine en yakın şekilde korunmasını sağlamak amacıyla yapılır.

Dokular hacimlarinin yaklaşık olarak 10 katı büyüklükte formalin sıvısı içine konulur (ideal sıvı %10'luk formalindir.) Doku büyüklüğüne göre bu sıvı içerisinde yaklaşık 4 saat bekletilir. 

dehidrasyon

Bu aşamada amaç dokuyu sertleştirip mikrotomda ince kesitler alınabilecek hale getirmektir.

Dokudaki su, alkol veya başka bir çözücü ile uzaklaştırılır. Dehidrasyon, dokunun sertleşmesini ve kalınlaşmasını sağlar. Dehidrasyonda en çok kullanılan ajan etanoldür diğeri ise asetondur. 

Doku alkol içerisinde kademeli olarak bekletilir. Bu alkol oranları %70'lik alkol, %80'lik alkol, %90'lık alkol, %96'lık alkol ve %100'lük absollü alkoldür.

Rutinde her bir alkolde 1 saat bekletilmektedir.

Bu aşamada doku yarı şeffaf hale getirilmektedir ve alkol yerine ksilen veya toulen sıvısı kullanılmaktadır. 

Bu sıvı hem dehidrantla hemde gömme sıvısıyla karışabilir haldedir.

ksilen yağları çözen bir sıvıdır.

bu aşam yakşalık 30-45 dakika sürer.

parafine gömme - Embedding

Amaç şeffaflandırıcı ajanı uzaklaştırmak ve dokuyu ince bir şekilde kesilecek materyal içerisine yerleştirmektir.

parafin 45-50 santigrat derecede erir ve daha düşük sıcaklıklarda donar. 

Parafin, petrolün damıtılmasıyla elde edilen, renksiz, kokusuz, mumsu bir maddedir. Erime noktası 45-60 °C arasındadır. Parafin, çeşitli endüstriyel ve tıbbi uygulamalarda kullanılır.

Patolojide parafin, doku takibi işleminde kullanılır. Doku takibi, hastadan alınan doku örneğinin incelenmeye hazır hale getirilmesi için yapılan bir dizi işlemdir. Doku takibinin üçüncü aşaması olan sertleştirme aşamasında, doku parafin ile muamele edilir. Parafin, dokuya sertlik kazandırır ve dokunun mikrotomda kesilmesine izin verir.

Parafin, patolojide kullanılmasının birkaç nedeni vardır:

• Parafin, dokuya sertlik kazandırır ve dokunun mikrotomda kesilmesine izin verir. Mikrotom, dokulardan ince kesitler almak için kullanılan bir cihazdır. Parafinle sertleştirilmiş dokular, mikrotomda kolayca kesilebilir ve incelenebilir.
• Parafin, dokuların yapısını bozmaz. Doku takibi sırasında kullanılan diğer kimyasallar, dokuların yapısını bozabilir. Parafin ise dokuların yapısını bozmaz ve dokuların doğal görünümünü korur.
• Parafin, dokuların uzun süre saklanmasına izin verir. Parafinle sertleştirilmiş dokular, uygun koşullarda saklanırsa, yıllarca bozulmadan kalabilir.

kesit alma

kesit alma genellikle mikrotom cihazında yapılır. İdeal kesit kalınlığı 3-5 mikrondur ve bu kalınlık dokuya göre değişebilmektedir.

Diğer kesit alma cihazı ise cryostattır. İçerisindeki sıcaklık -30 dereceye kadar inen bu cihaz daha çok acil vakalarda dokuyu tanımlamak için kullanılmaktadır.

Mikrotom ve kriyostat cihazları, histoloji ve patoloji laboratuvarlarında doku örneklerinin incelenmesi için kullanılan önemli araçlardır. Aralarındaki temel farklar şöyledir:

Mikrotom: Parafine gömülü doku örneklerinden ince kesitler almak için kullanılan bir cihazdır. Rotary (döner) ve kızaklı olmak üzere iki ana tipi vardır. Rotary mikrotomlar, dikey kızak sistemi üzerinde blok tutucu başlığın aşağı-yukarı hareketi ile bıçak tutucu başlığa sürtünmesi sonucu kesit alır. Bu sayede ışık mikroskobu için 3-60 mikron aralığında ince ve seri kesitler elde edilebilir.

Kriyostat: Taze, dondurulmuş doku örneklerinden kesit almak için kullanılan bir cihazdır. Doku örnekleri, soğuk ortamda (-20°C ila -30°C) dondurulur ve özel bıçaklar kullanılarak kesitler alınır. Kriyostatlar, acil cerrahi biyopsilerde ve özel boyama teknikleri gerektiren durumlarda tercih edilir.

Temel olarak, mikrotomlar parafine gömülü sabit doku örneklerinden, kriyostatlar ise taze, dondurulmuş doku örneklerinden kesit almak için kullanılır. Mikrotomlar ışık mikroskobu için ince kesitler sağlarken, kriyostatlar daha hızlı sonuç alınmasını ve özel boyama teknikleri uygulanmasını mümkün kılar

boyama 

3-5 mikronda kesilen dokular mikroskopta gözükebilmesi için boyanır. En çok kullanılan boyama yöntemi ise hematoksilen-eozin boyasıdır ve bazik maddeler mavi-mor ile boyanırken asidik maddeler ise kırmızı renkte boyanır.

karaciğerde meydana gelen bir kanserin mikroskop görüntüsü

Hematoksilen eozin boyama basamakları

1. ksilen - (5-10 dakika)
2. absollü alkol (5-10 dakika)
3. %95'lik alkol (5-10 dakika)
4. %75'lik alkol (5-10 dakika)
5. suda yıkama (5-10 dakika)
6. hematoksilen (1 dakika)
7. suda yıkama (1 dakika)
8. eozin (1 dakika)
9. suda yıkama (1 dakika)
10. %75'lik alkol (5-10 dakika)
11. %95'lik alkol (5-10 dakika)
12. absollü alkol (5-10 dakika)
13. ksilen - (5-10 dakika)

Doku takip işlemlerinde ksilen kullanılmasının temel nedeni, dokuların şeffaflaştırılması (clearing) aşamasında rol oynamasıdır. Ksilen, doku örneklerindeki yağ ve lipid yapılarını uzaklaştırarak dokuları şeffaf hale getirir.

Absollü alkol, %99,9 saflıkta etanol içerir. Bu, diğer alkol türlerine kıyasla çok daha yüksek bir saflık seviyesidir.

Hematoksilen, Meksika'da yetişen haematoxylen campechianum türü küçük bir ağacın kabuklarından elde edilen bir bileşiktir. Kendisi doğrudan bir boya değildir, ancak oksidatif ajanlar ve mordantlar ile işlenerek boya çözeltisi haline getirilebilir.

Hematoksilen, sodyum iyodat (NaIO3) veya cıva oksit (HgO) gibi oksidasyon ajanları ile okside edilir. Daha sonra, aluminyum, demir veya tungsten tuzları gibi mordantlar ile renklerinin sabitlenmesi sağlanır. Bu işlemler sonucunda, hematoksilen boya çözeltisi elde edilir.

Hematoksilen, patoloji ve histoloji laboratuvarlarında sıklıkla kullanılan bir boyama maddesidir. Çekirdek (nükleus) ve kalsiyum çöküntülerini mavi-mor renginde boyar. Eozin ile kombine edilerek Hematoksilen-Eozin (H&E) boyama yöntemi oluşturulur, bu da en yaygın kullanılan histolojik boyama tekniğidir.

Eozin, rutin histolojik boyama tekniklerinde hematoksilen boyalarına zıt olarak sitoplazma boyamasında kullanılır. Günümüzde en yaygın kullanılan eozin türü, eozin Y (eosine yellowish) formudur. Diğer eozin türleri olan eozin S ve eozin B ise daha sınırlı kullanıma sahiptir.

Doğal hali sarı-yeşil renkte olan eozin, %1'lik asetik asit ilavesiyle kırmızı renge dönüşür. Bu işlem, hematoksilen ile mavi renge boyanan çekirdek (nükleus) yapılarına parlak bir kontrast sağlar. Böylece, hücresel detaylar daha belirgin hale gelir.

Eozin, sitoplazma, protein birikimi ve amiloid gibi yapıları pembe-kırmızı renginde boyar. Hematoksilen ile birlikte kullanıldığında, Hematoksilen-Eozin (H&E) boyama yöntemi oluşur. Bu, patoloji ve histoloji laboratuvarlarında en yaygın kullanılan histolojik boyama tekniğidir.

Sonuç olarak, eozin boyası, hematoksilen ile birlikte kullanılarak doku ve hücre yapılarının ayrıntılı incelenmesine olanak sağlar. Asetik asit ilavesiyle elde edilen kırmızı renk, hücresel detayların daha belirgin bir şekilde görüntülenmesine katkı sunar.

Hematoksilen ve eozin boyası, histoloji ve patoloji laboratuvarlarında en sık kullanılan boyama tekniklerinden biridir. Aşağıda bu boyama yönteminin özellikleri yer almaktadır:

Hematoksilen, alkali pH'a sahip bir boya maddesidir ve hücre çekirdeğini (nükleik asit) ve kalsiyum çöküntülerini mavi-mor renginde boyar. Eozin ise pembe-kırmızı renkte olup sitoplazma, protein birikimi, amiloid gibi yapıları boyar.

HxE boyama, histopatolojik analizlerde en sık kullanılan ve yüzyılı aşkın süredir histopatologların en vazgeçilmez yöntemidir. Sadeliği, düşük maliyeti, ileri teknik altyapı gerektirmemesi ve kolay uygulanabilirliği nedeniyle günümüzün hızla gelişen biyomedikal araştırma yöntemlerine rağmen önemini korumaktadır.

mavi-mor boyanan yapılar;

• çekirdek,
• ribozom,
• granüllü endoplazmik retikulum.

kırmızı boyanan yapılar;

• sitoplazma,
• mitekondri,
• kollajen lifler,
• lizozomlar.

Genel amaçlı boyama yöntemleri;

1. Harris Hematoksilen-Eozin boyama,
2. Mayer Hematoksilen boyama yada Mayer'in musikarmin boyası,
3. Delafield Hematoksilen boyama,
4. Erlich Hematoksilen boyama,
5. Böhmer Hematoksilen boyama.

Patoloji laboratuvarlarında doku örneklerini incelemek için kullanılan özel amaçlı boyama yöntemleri şunlardır:

1. Periodic Acid-Schiff (PAS) Boyama:
• Karbonhidrat yapıları, bazal membranlar ve glikojen gibi yapıları boyar.
• Diyabet, böbrek hastalıkları ve mantar enfeksiyonlarının tanısında kullanılır.
2. Masson Trikrom Boyama:
• Kollajen, kas dokusu ve fibrin gibi yapıları farklı renklerle boyar.
• Fibrozis ve siroz tespitinde kullanılır.
3. Alcian Blue Boyama:
1. Asit mukopolisakkaritler ve glikozaminoglikanları boyar.
2. Kartilaj ve mukus salgılayan hücreleri gösterir.
4. Oil Red O Boyama:
• Lipidleri boyar.
• Yağlı dejenerasyon ve lipom tanısında kullanılır.
5. Giemsa Boyama:
• Kromatin paterni, parazitler ve mikroorganizmaları boyar.
• Lösemi ve enfeksiyöz hastalıkların tanısında kullanılır.
6. Gram Boyama:
• Gram pozitif ve gram negatif bakterileri ayırt eder.
• Bakteriyel enfeksiyonların tanısında kullanılır.

Bu özel boyama yöntemleri, rutin H&E boyamasına ek olarak doku ve hücre yapılarındaki spesifik molekülleri veya antijenleri tespit etmek için uygulanır. Böylece patoloji uzmanları, doku örneklerindeki morfolojik değişiklikleri daha detaylı olarak değerlendirebilir.

Kapama

Patoloji laboratuvarlarında doku kesitlerinin lamel ile kapatılması (montaj) işlemi aşağıdaki şekilde gerçekleşir:

• Boyama işlemlerinden sonra, kesitler su banyosuna alınır ve lamel yerleştirilecek şekilde düzenlenir.
• Lamel altına, kesitlerin üzerini kaplayacak miktarda entellan veya permount gibi kapatma vasatı damlatılır.
• Lamel, kesitlerin üzerine yavaşça indirilir. Hava kabarcıklarının oluşmamasına dikkat edilir.
• Lamel üzerindeki fazla kapatma vasatı, temiz bir kağıt havlu ile nazikçe emilir.
• Slaytlar, kapatma işleminden sonra en az 24 saat oda sıcaklığında kurumaya bırakılır.
• Kuruma tamamlandıktan sonra, slaytların kenarları entellan veya permount ile kapatılır. Bu işlem, lamel kenarlarındaki boşlukları doldurarak kesitlerin korunmasını sağlar.
• Kapatılan slaytlar, mikroskobik inceleme için hazır hale gelir.
• Otomatik kapatma cihazları da kullanılabilir. Bu cihazlarda, kesitler özel kapatma kaslarına yerleştirilir ve cihaz, lamel indirme, hava kabarcığı giderme ve fazla vasatı emme işlemlerini otomatik olarak gerçekleştirir.

Kapatma işlemi, doku kesitlerinin uzun süre korunması ve mikroskobik inceleme için uygun hale getirilmesi açısından önemlidir. Doğru teknikle yapılan kapatma, kesitlerin kalitesini ve görüntüsünü artırır.

Kapama malzemesi olarak Kanada balsamı ve entellan kullanılabilmektedir.